PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) katsetes võivad pakendid tunduda lihtsad, kuid see mõjutab otseselt reaktiivi stabiilsust, kasutusmugavust ja usaldusväärseid tulemusi. Ükskõik, kas labori - säilitamine ja transportimine on ette valmistatud reagentide või kommertsprojektide valmistamine, võib PCR -i pakkimistehnikate valdamine vältida tavalisi vigu ja parandada eksperimentaalset tõhusust. Allpool jagame praktilisi näpunäiteid materjali valimise, pakendistrateegiate ja ladustamise üksikasjade kohta.
I. Pakendimaterjali valik: ühilduvuse ja kaitsmise tähtsustamine
PCR -reaktsioonid on tundlikud temperatuuri, valguse ja saasteainete suhtes, seega peavad pakendimaterjalid vastama kolmele põhinõuele: õhukindlus, valgus - tõestamine ja keemiline inerts.
Tsentrifuugitorude ja PCR -plaatide puhul eelistatakse polüpropüleeni (PP), kuna selle kõrge läbipaistvus ja DNase/RNase - vabad atribuudid . 0.2 ml õhuke - seinaga PCR -toubid on ideaalsed, samas kui 0,5 ML -id on paremad. 96 - kaevu PCR-plaatide jaoks soovitame valida seeliku kujunduse (robotikannipuleerimise hõlbustamiseks) või mitteseelikulise disaini (kosmosekaitse jaoks).
Tihendusmeetod: tavalised tsentrifuugitorud kasutavad tasaseid või tõstetud korke (aurustumise ja kuivamise vältimiseks). Pika - termini salvestusruumi jaoks on sisemise ja välise rõhu tasakaalustamiseks soovitatav soojust - tihendada kile (näiteks Parafilm) või hingavat kilet (näiteks aeraseal). PCR -plaadid on soovitatav kasutada kleepuvaid alumiiniumfooliumi tihendajaid (kõrge - temperatuurikindlad) või self - liimi kile (ühe - jaoks).
Valguskaitse: valgust - tundlikke koostisosi (näiteks teatud värvaineid või praimereid) sisaldavad reaktiivid tuleks mähkida alumiiniumfooliumisse või tuleks kasutada mustad PCR -plaadid (saadaval mõnede tootjate poolt).
Ii. Alikvootimise tehnikad: korduva külmutamise - kadude minimeerimine sulatab tsüklid
Alikvootidega reagendid on PCR -pakendi põhietapp ja mõjutab otseselt eksperimentaalset reprodutseeritavust.
Master Mixi alikvootimine: kommertsmeistri segud (näiteks TAQ ensüüm ja DNTP segu) on soovitatav reaktsiooni mahu põhjal alikvootimiseks pluss 5% - 10% marginaali (nt 20 μl reaktsiooni jaoks, alikvoot 22 μl toru kohta). Vältige otse puistepakenditest kasutamist, kuna korduv külmutamine - sula tsüklid võivad põhjustada ensüümide aktiivsuse vähenemist (TAQ ensüüm võib kaotada umbes 5% aktiivsuse külmutamise-sulatatud tsükli kohta).
Praimerid ja mallid: praimerid (eriti kohandatud praimerid) on soovitatav olla alikvootimine 100 μm aktsialahustest ja salvestada - 20 kraadi. Enne kasutamist lahjendage töökontsentratsiooni (tavaliselt 0,1–1 μm). Sellised mallid nagu genoomne DNA tuleks ristsaastumise vältimiseks ühes - alikvootiga kasutada koguseid.
Saastumise ennetamise näpunäited: veenduge, et tsentrifuugitorud oleksid enne alikvootimist kuivasid (jääk etanool võib pärssida PCR -i), eel - jahedaid pipetiotsid, et vältida külmade reagentide kleepumist seina külge, ja kandke kogu protsessi kogu protsessi vältel, et vältida naha DNA saastumist.
Iii. Märgistamine ja salvestus: vältige lõksu "must kast"
Selge märgistamine on PCR -pakendi jaoks ülioluline; Vale märgistamine võib kogu katse rikkuda.
Kohustuslik märgistamise teave: reagendi nimi (nt "2 × Taq MasterMix"), kontsentratsioon/sisu (nt "10 mm DNTPS"), partii arv (jälitavuse jaoks), salvestusolud (nt "valguse eest kaitstud"), alikvoodi kuupäev ja alija kuupäev (nt kasutamine 6 kuu jooksul ").
Spetsiaalne märgistamine: kui reaktiiv sisaldab glütserooli (antifriisi), värvaineid (nt Sybr Green) või lisaaineid (nt BSA), tuleb esitada lisateave (nt "sisaldab 50% glütserooli, ei ole kõrgel temperatuuril").
Salvestage sünkroonimine: iga toru sisu üksikasjalike parameetrite (nt praimerijärjestuse, TM väärtus) salvestamiseks on soovitatav kasutada arvutustabeli või laboratoorse haldustarkvara (nt Labguru) ja seostada neid füüsilise sildi numbriga.
IV. Ladustamine ja transport: temperatuuri ja füüsilise kaitse tasakaalustamine
PCR -reagentide stabiilsus sõltub suuresti ladustamistingimustest ja transpordi ajal on vaja täiendavat kaitset.
Üldine ladustamine:
Ensüümid (Taq, pöördtranskriptaas): pikk - termini salvestusruum - 20 kraadi (vältige korduvaid külmutamise -sulatatud tsüklit; alikvoot ja hoidke tulevaseks kasutamiseks -80 kraadi);
Praimerid/sondid: ladustage -20 kraadi üle ühe aasta (kui see sisaldab modifitseeritud rühma nagu biotiin, kaitse valguse eest);
Non - ensüümipuhvrid (nt, PBS): lühike - termini salvestusruum 4 kraadi (kuni 1 kuu) juures.
Transpordinõuded:
Külma ahela transportimiseks kasutage ensüümide jaoks (- 78 kraadi) (hoitakse alla -20 kraadi) ja sinise jääga (umbes 0 kraadi) puhvrite jaoks lühiajaliseks transportimiseks.
Vältige liigset vibratsiooni (PCR -plaadid tuleks kinnitada vahtkastidesse, et vältida reaktiivide segunemist kaevude vahel).
Suvisel temperatuuril lisage pakendile isoleeriv kiht (nt alumiiniumfooliumi isolatsioonikott + külmutatud geelipakk).
V. Levinud probleemid ja lahendused
1. probleem: reaktiivi sademed (nt DNTPS või MGCL₂ sademed madalatel temperatuuridel) → Lahendus: lühidalt tsentrifuug (1000 p / min, 1 minut) enne alikvooti. Lahustage enne kasutamist 37 -kraadises inkubaatoris ja vortex, et põhjalikult seguneda.
2. probleem: plaadi tihendaja koorib kergesti välja → Lahendus: valige kuum - vastupidav tihendaja kleepuva taustaga või kasutage soojus tihendajat (sobib kõrge - läbilaskekatsete jaoks).
3. probleem: hägused sildid → Lahendus: kasutage veekindlat markerit (näiteks Sharpie) või laser - prindisildid, et alkoholi kustutada käekiri.
Järeldus
PCR -pakend on midagi enamat kui lihtsalt "pakendi" reagendid; See on eksperimentaalse usaldusväärsuse esimene kaitseliin. Valides sobivaid materjale, standardiseerides alikvootimisprotsessi, säilitades põhjaliku märgistamise ja range temperatuuri kontrolli säilitamise transpordi ajal saate märkimisväärselt vähendada inimlikke vigu, tagades stabiilsemad järgnevamad amplifikatsioonireaktsioonid ja usaldusväärsemad tulemused. Pidage meeles: üksikasjad määravad edu. Nõuete PCR -pakendipraktikad võivad kogu teie katse vältel säästa märkimisväärset tõrkeotsingut!